Izolace nukleových kyselin představuje základní a nevyhnutný první krok v široké škále experimentů molekulární biologie. Cílem tohoto procesu je získat cílovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA) v dostatečném množství a především ve vysoké kvalitě, tedy zbavenou jakýchkoliv „nadbytečných“ látek, tzv. kontaminantů. Kvalita templátové DNA ovlivňuje účinnost amplifikace v průběhu PCR a nečistoty obsažené ve vzorku mohou polymerasovou reakci výrazně zpomalovat.
Lýza buněk jako východiskový bod
Výběr metody izolace záleží od způsobu, jakým se bude nukleová kyselina v dalším postupu analyzovat. Aby došlo k uvoľnění nukleové kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány. Pokud se DNA izoluje z buněk (např. z částečky tkáně, buněk bukální sliznice získaných stěrem, leukocytů periferní krve), je obvykle prvním krokem homogenizace tkáně a lýza buněk.
- Bakteriální lýza: Pro lýzu bakteriálních buněk se často využívá enzymatické opracování bunkovej steny lyzozýmom, který hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch.
- Rastlinná lýza: Při izolaci nukleových kyselin z rostlinných buněk se prvotne pristupuje k mechanickému a enzymatickému opracování bunkovej steny pomocou celuláz.
- Živočišné tkáně: Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napr. pôsobením slabých neionogénnych detergentov v kombinácii s proteolytickými enzýmami, ako je proteináza K.
Při lýze se uvolní celý obsah buněk do roztoku, přičemž vznikne komplexní směs obsahující zbytky buněčných stěn a membrán, proteiny, nukleové kyseliny a polysacharidy. K rozpadu buněčných struktur přispívá degradace proteinů pomocí enzymů proteáz, např. proteinázy K.
Fantastické kroky extrakce DNA!
Purifikace nukleových kyselin z lyzátu
Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. Kontaminující bílkoviny se hydrolyzují proteázami a/nebo denaturují a vysráží.
Organická extrakce (Fenol-chloroformová metoda)
Fenol-chloroformová technika je stále „zlatým standardem“ purifikace nukleových kyselin. Při pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zůstává rozpuštěna ve vodné fázi, zatímco proteiny se denaturují a vypadávají do hydrofobní fáze. Ke směsi se přidává malé množství izoamylalkoholu, který usnadní oddělení fází a zabrání pěnění při zpracování vzorků bohatých na proteiny.
Moderní metody: Silikát a magnetická separace
Extrakce pomocí silikátové pevné fáze je relativně jednoduchá, hodí se i pro automatizaci. Přídavkem vysoké koncentrace tzv. chaotropních solí při vhodném pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svými fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA.
Při magnetické separaci se DNA reverzibilně váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchem. Po navázání DNA se kuličky pomocí magnetu oddělí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Magnetická separace je vhodná k automatizaci a používá se především pro zpracování velkých počtů vzorků.
| Metoda | Princip | Výhoda |
|---|---|---|
| Fenol-chloroform | Organická extrakce | Vysoký výtěžek a čistota |
| Silikátové kolónky | Adsorpce na silikagel | Jednoduchost, automatizace |
| Magnetické kuličky | Magnetická separace | Koncentrovaný vzorek, škálovatelnost |
Zrážení nukleových kyselin alkoholem
Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie, najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom. Nejprve se přidá ve velké koncentraci vhodná sůl (chlorid sodný, octan sodný apod.). Její ionty si vytvářejí hydratační obal, čímž odejmou DNA rozpouštědlo (tzv. vysolování).
Vyzrážaná nukleová kyselina se nazývá precipitát. Precipitát DNA se od roztoku oddělí vysokootáčkovou centrifugací. Premytím 70% etanolom se odstraní zbytky solí přítomné v precipitátu a precipitát se vysuší tak, aby se odpařily zbytky etanolu, ale zároveň aby DNA zůstala hydratovaná. Izolovaná a přečištěná DNA se poté zpravidla rozpouští v alkalickém pufru, který obsahuje etylendiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA), aby se zabránilo její spontánní degradaci.