Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Voľba metódy extrakcie DNA závisí od toho, k čomu ju budeme ďalej používať. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov. Kvalita templátovej DNA však ovplyvňuje účinnosť amplifikácie v priebehu PCR a nečistoty obsiahnuté vo vzorke môžu polymerázovú reakciu výrazne spomaľovať. Nečistoty reakciu spomaľujú tým, že pôsobia ako inhibítory polymerázy, alebo tým, že sa viažu na templátovú DNA a zneprístupňujú ju tak polymerázovej reakcii.
Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Napríklad, pri použití metódy PCR (polymerázová reťazová reakcia) postačujú malé množstvá DNA, ktorej čistota a integrita nie sú vo väčšine prípadov kritické. Na druhej strane, pri klonovaní, enzymatickom opracovaní DNA restrikčnými endonukleázami alebo pri sekvenovaní sú potrebné relatívne väčšie množstvá DNA s vyššou čistotou.
Zdroje DNA a špecifiká ich získavania
Nukleové kyseliny je možné izolovať z rôznych zdrojov. DNA možno teoreticky izolovať z akejkoľvek živočíšnej tkaniva obsahujúcej živé bunky.
Živočíšne zdroje
U obratlovcov, ktorých erytrocyty majú jadro, sa dá DNA ľahko izolovať z krvi. U savcov je izolácia DNA z krvi problematickejšia a vyžaduje pomerne veľké množstvo krve. Pri použití špeciálnych techník je možné izolovať DNA aj z takých zdrojov, ako sú jednotlivé chlupy alebo trus. Často možno izolovať DNA aj z muzejného materiálu, pričom dobrým zdrojom sú hlavne tkanivá uchovávané v liehu. Naopak, izolácia DNA zo vzoriek, ktoré prišli do styku s formalínom, často končí neúspechom. Pri izolácii tkanív uchovávaných vo formalíne sa v prvých krokoch izolácie niekedy pridáva DTT alebo sa využívajú špeciálne kity. V prípade izolácie nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov (myšacia slezina, pečeň, mozog) je potrebná homogenizácia vstupného materiálu.
Rastlinné a bakteriálne zdroje
Vo všeobecnosti sa ťažšie izolujú nukleové kyseliny z rastlinných buniek kvôli prítomnosti kompaktnej celulózovej bunkovej stene a chemických zlúčenín obsiahnutých vo vakuolárnej šťave. V prípade, že sa bunková kultúra pestuje v tekutom médiu, je prvým krokom izolácie oddelenie buniek od média centrifugáciou. V prípade niektorých baktérií, ktoré majú veľmi hrubú bunkovú stenu alebo tvoria veľa sekundárnych metabolitov, je výhodné izolovať DNA z buniek v logaritmickej fáze rastu, t.j. pri ich aktívnom hromadnom delení. DNA môže byť izolovaná aj z extrémnych zdrojov ako je pôda, úžitková voda, potraviny a iné. Zdrojom nukleových kyselín môžu byť aj subcelulárne častice - organely alebo vírusy, ktoré získame po izolácii centrifugáciou v hustotnom gradiente.
Tabuľka vhodnosti materiálov
| Typ vzorky | Náročnosť izolácie | Kvalita výťažku |
|---|---|---|
| Krv (vtáky) | Nízka | Vysoká |
| Krv (cicavce) | Stredná | Vysoká |
| Tkanivá v liehu | Stredná | Vysoká |
| Formalínové vzorky | Vysoká | Nízka/Variabilná |
Všeobecné kroky izolácie DNA: od lýzy po purifikáciu
Ak sa DNA izoluje z buniek, je obvykle prvým krokom homogenizácia tkaniva a lýza buniek. Na uvoľnenie obsahu rastlinných buniek obalených bunkovou stenou sa používa v prvom kroku mechanické ako aj enzymatické opracovanie (celulázy). K tomuto účelu je možné použiť mechanické rozdrvenie v homogenizátore alebo rozrušenie bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku. Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napríklad pôsobením slabých neionogénnych detergentov (napr. Triton X-100) v kombinácii s proteolytickými enzýmami.
Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány. Buněčné a jadrové membrány sa obvykle rozpúšťajú účinkom tenzidov. Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch. Tento enzým sa prirodzene vyskytuje vo vaječnom bielku (zdroj na izoláciu) a v slzách. Druhým krokom je rozrušenie cytoplazmatickej membrány bakteriálnej bunky pôsobením ionogénnych detergentov (detergentov tvoriacich ióny), napríklad SDS − dodecylsulfát sodný. Nevzácne je treba okrem chemickej lýzy použiť aj mechanickú lýzu bakteriálnych buniek pomocou ultrasonikátora, ktorý na disrupciu buniek využíva ultrazvukové vlny.
02 - Izolácia DNA z bakteriálnej kultúry
K rozpadu bunkových štruktúr prispieva degradácia proteínov pomocou enzýmov proteáz, napríklad proteinázy K. Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napr. EDTA − kyselina etyléndiamíntetraoctová), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy. Neprítomnosť dvojmocných katiónov zároveň destabilizuje vonkajšiu bakteriálnu membránu.
Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a bunkových membrán, proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a rôzne nízkomolekulové zložky (obzvlášť dôležité pri izolácii z rastlinných buniek kvôli prítomnosti chemických zlúčenín vakuolárnej šťavy). Aby nedochádzalo k degradácii izolovanej nukleovej kyseliny je potrebné použiť čo najmiernejšie podmienky lýzy, t.j. uskutočňovať ju v tlmivom roztoku a v chlade. Vzniklý lyzát obsahuje okrem DNA rad kontaminujúcich látok - všetky nízkomolekulárne aj vysokomolekulárne súčasti tkaniva alebo buniek. Nasleduje preto extrakcia a purifikácia DNA z lyzátu.
Metódy purifikácie a spracovania DNA
Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. Pri izolácii nukleových kyselín je dôležité odstrániť zo zmesi proteíny, medzi ktoré patria aj bunkové nukleázy, ktoré môžu degradovať izolovanú nukleovú kyselinu, ako aj proteíny viažúce sa na DNA, ktoré svojou prítomnosťou môžu rušiť následné analýzy (napríklad štiepenie restrikčnými endonukleázami).
Fenol-chloroformová extrakcia
Fenol-chloroformová technika je stále „zlatým štandardom“ purifikácie nukleových kyselín. Metóda je ale časovo náročná a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami. Pri spracovaní veľkého počtu vzoriek sa obtiažne automatizuje. Napriek tomu, že je náročnejšia na čas a pracuje sa pri nej s nebezpečnými chemikáliami, umožňuje dosiahnuť vysokých výťažkov a získať prakticky čistú DNA.
Na odstránenie proteínov z preparátov nukleových kyselín sa často používa extrakcia organickými rozpúšťadlami (fenol, chloroform = trichlórmetán). Prvým krokom je homogenizácia tkaniva v pufru, ktorý obsahuje tenzid (napr. dodecylsíran sodný, SDS). Tenzid rozpustí bunkové membrány. Rozpad buniek sa usnadňuje přídavkom proteinázy K. Tento účinný bakteriálny enzým, ktorý má teplotné optimum okolo 60 °C, nevyžaduje vápenaté ani hořečnaté ióny a ktorý neinhibujú ani koncentrované tenzidy, čiastočne hydrolyzuje kontaminujúce bielkoviny. Následuje denaturace bílkovín a jejich vysrážení směsí fenolu a chloroformu.
Tieto látky sú s vodou nemiešateľné, a preto sa po ich pridaní k vodnému roztoku nukleových kyselín vytvoria dve fázy. Pri premiešaní takejto zmesi dochádza na fázovom rozhraní k denaturácii proteínov. Fenol-chloroformová zmes sa nemieša s vodou. Pri pH roztoku nad 7,6 je DNA disociovaná a zostáva rozpustena vo vodnej fáze, zatiaľ čo proteiny sa denaturujú a vypadávajú do hydrofobnej fáze. K zmesi sa pridáva malé množstvo izoamylalkoholu, ktorý usnadní oddelení fáz a zabrání pěnění pri spracovávání vzoriek bohatých na proteiny. Po fenolovej extrakcii je dôležité zbaviť roztoky nukleových kyselín zvyškov fenolu, pretože fenol môže inhibovať následné enzymatické reakcie (napríklad restrikčné štiepenie).
Alkoholové zrážanie a rekondenzácia DNA
Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie (najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom). Najprv sa pridá vo veľkej koncentrácii vhodná soľ (chlorid sodný, octan sodný apod.). Jej ióny si vytvárajú hydratačný obal, čím odejmú DNA rozpúšťadlo (tzv. vysolovanie). Potom sa k zmesi pridá málo polárna látka (napr. etanol alebo izopropanol).
Zrážanie sa robí v prítomnosti jednomocných iónov (napr. 0,1 M octan sodný) a pri nízkej teplote (-20 °C). V týchto podmienkach je výťažok kvantitatívny aj pri nízkej koncentrácii DNA. Na druhej strane, zrážanie pri laboratórnej teplote (+20 °C) je výhodné, ak chceme vyzrážať DNA bez súčasného vyzrážania („oživenia”) kontaminujúcej RNA. Vyzrážaná nukleová kyselina sa nazýva precipitát.
Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná. Molekula DNA v kyslom prostredí môže spontánne degradovať, a preto sa DNA rozpúšťa v slabo zásaditom tlmivom roztoku s prídavkom EDTA (tzv. roztok TE). Izolovaná a prečistená DNA sa potom zpravidla rozpúšťa v alkalickom pufru, ktorý obsahuje etyléndiaminotetraoctovou kyselinu (EDTA).
Alkalická lýza pre plazmidy
Táto metóda sa používa pri izolácii plazmidov z bakteriálnych buniek za súčasného odstránenia chromozomálnej DNA. Bakteriálne bunky sú lyzované v alkalickom prostredí (0,2 M NaOH) v prítomnosti detergentu (1 % SDS). Chromozomálna DNA je pri lýze fragmentovaná na lineárne molekuly, zatiaľ čo plazmidová DNA, ktorá má podstatne menšiu veľkosť, si zachová cirkulárnu formu. Pri pH okolo 12, ktoré je v roztoku, dochádza k denaturácii DNA, t.j. vodíkové väzby medzi bázami sa uvoľnia a vznikajú jednovláknové molekuly. Po neutralizácii roztoku (octanom draselným) kruhová plazmidová DNA renaturuje do pôvodnej dvojvláknovej formy, ale lineárne molekuly chromozomálnej DNA nie sú schopné tak rýchlo renaturovať, a preto agregujú s inými zložkami lyzátu (bunkové steny a membrány, proteíny, SDS).
Ultracentrifugácia
DNA môže byť purifikovaná zo zmesi makromolekúl ultracentrifugáciou za pomoci chloridu cézneho (CsCl) a etídium bromidu. DNA sa skoncentruje do úzkeho prúžku v strede gradiantu, pričom lineárna a cirkulárna (plazmidová) DNA majú inú hustotu, a preto je možné ich touto metódou navzájom oddeliť. Po centrifugácii sa vyberú frakcie obsahujúce DNA, etídium bromid sa odstráni extrakciou n-butanolom a DNA sa z roztoku získa etanolovou precipitáciou. Výsledkom tejto techniky je vysokomolekulárna DNA s vysokou čistotou.
Moderné alternatívy: Silikátová pevná fáza a magnetická separácia
Využívajú sa aj moderné alternatívy, ako je extrakcia pomocou silikátovej pevnej fázy, ktorá je relatívne jednoduchá a hodí sa aj pre automatizáciu. Využívajú sa křemičité kuličky s velkým povrchem, ktorými je napríklad naplnená krátka chromatografická kolonka. Vo vodných roztokoch je povrch silikátu hydratovaný. Prídavkom vysokej koncentrácie tzv. chaotropných solí pri vhodnom pH dojde k rozbití vodíkových můstků mezi molekulami vody a povrchem silikátu. Na takto dehydratovaný silikát se svojimi fosfátovými skupinami s vysokou afinitou váže DNA. Kontaminující látky je potom možné odmýt.
Magnetická separácia je vhodná k automatizácii a používa sa predovšetkým pre spracovanie veľkých počtov vzoriek. Pri magnetickej separácii sa DNA reverzibilne váže na magnetické kuličky potažené vhodným povrchom - protilátkami proti DNA, silikátem, iontoměničem alebo povrchem s inými vhodnými funkčnými skupinami. Po naviazaní DNA sa kuličky pomocou magnetu oddelí od roztoku s kontaminujícími látkami a opakovaně se promyjí. Výťažky a čistota DNA sú srovnatelné so silikátovou extrakciou, je však možné izolovanú DNA získať v menšom množstve roztoku (tj. koncentrovanejšiu). K reverzibilnej imobilizácii DNA na nosič dochádzalo v prostredí vysokej koncentrácie NaCl a poly(etylénglykolu) (PEG). Pre naviazanie DNA na magnetické mikročástice bola navozená kondenzácia DNA pomocou 2 M NaCl a PEG s molekulovou hmotnosťou 6000, kedy výsledná koncentrácia PEG v separačnej zmesi bola 8 a 16 %. Používajú sa aj špecifické riešenia ako Magnetická separácia s použitím Dynabeads®.
Špecifiká izolácie RNA
Pri izolácii RNA z akéhokoľvek biologického materiálu je hlavným problémom jej nestabilita. Molekula RNA podlieha degradácii oveľa ľahšie ako DNA a zároveň ribonukleázy sú vo všeobecnosti veľmi stabilné a všadeprítomné enzýmy, ktoré nepotrebujú k svojej aktivite ako kofaktory dvojmocné ióny, na rozdiel od DNáz. Vedeli ste, že...? RNáza sa skutočne vyskytuje všade. Vylučuje sa aj potnými žľazami na končekoch prstov, takže práca bez rukavíc je absolútne neprípustná.
Metódy izolácie a purifikácie RNA sú založené na rýchlej lýze buniek, ktorá efektívne neutralizuje prítomné nukleázy. Kontaminujúce bielkoviny sa odstraňujú fenolovou extrakciou v kyslom prostredí alebo na silikagélových kolónkach. Zvyšky chromozomálnej DNA je možné rozložiť pôsobením DNázy. Purifikovaná RNA sa využíva na prípravu komplementárnej DNA (cDNA), northernovu hybridizáciu, RT-PCR, alebo na in vitro transláciu.
Pri mnohých aplikáciách je výhodné použiť iba frakciu mRNA. V princípe, izolácia mRNA spočíva vo využití prirodzenej enzymatickej posttranskripčnej modifikácie eukaryotickej mRNA, a to je pridávanie poly(A)-chvostíka na 3'-koniec molekuly mRNA za pomoci enzýmu poly(A)-polymerázy. Oligo-dT nosiče sú jednoduché plôšky, na ktorých sú fixované jednovláknové molekuly so sekvenciou poly(T), a teda sú komplementárne k jednovláknovým mRNA s poly(A) koncami. Ak sa roztok s prítomnými mRNA naleje na tieto nosiče, v prostredí s vyššou iónovou silou (pridanie solí) dochádza k hybridizácii, a teda zachytávaniu mRNA na týchto nosičoch.
Aplikácie izolácie DNA pre PCR v praxi
Niekedy postačujú veľmi malé množstvá DNA pre molekulárno-genetické vyšetrenie polymerázovou reťazovou reakciou. Niekedy možno dokonca použiť priamo časť tkaniva alebo niekoľko buniek lyzovaných napr. hydroxidom, tenzidmi alebo zmrazovaním a rozmrazovaním.
Rozvoj molekulárnej biológie a aplikácie typu PCR v rutínnej diagnostike otvárajú úplne nové trendy aj vo skríningu tumorov GIT. Najnovšie skríningové metódy sú založené na detekcii špecifických mutácií metódami PCR v DNA izolované zo vzorky stolice. Komerčne ponúkané súpravy zaisťujú izoláciu 10 − 30 μg DNA zo vzorky 220 mg stolice počas päťdesiatminútového procesu a odstránenie inhibítorov pre ďalšiu PCR analytiku.
Príklad štúdie: Izolácia DNA z probiotických kmeňov a fermentovaných mliečnych výrobkov
V diplomovej práci bola študovaná izolácia kyseliny deoxyribonukleovej (DNA) pomocou troch rôznych metod: fenolovou extrakciou, vysolováním chloridom sodným a magnetickou separáciou využívajúcou reverzibilné adsorpce nukleových kyselín na rôzne magnetické nosiče. Cieľom bolo získať DNA v kvalite vhodnej pre polymerázovú reťazovú reakciu (PCR).
K izolácii DNA bolo využito 5 rôznych vhodne funkcionalizovaných nosičov: magnetického silikagelu, P(HEMA-co-GMA) ox. I, P(HEMA-co-GMA) ox. II, Dynal DNA Direct a Perovskit 439. DNA bola izolovaná z bakteriálnych kultúr troch sbírkových probiotických kmeňov, L. amylovorus CCM 4380T, L. zeae CCM 7069 T, L. plantarum CCM 7039T, ktoré boli kultivované na médiu MRS. DNA bola taktiež izolovaná z fermentovaných mliečnych výrobkov: Jihočeský zákys s ovocem jahoda (kysaný mliečny výrobok s probiotickou kultúrou Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium lactis a Streptococcus thermophilus), Revital active (bílý jogurt s inulinem a probiotickou kultúrou Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus a Bifidobacterium sp.) a Actimel višeň (mliečny výrobok s obsahem probiotickej kultúry Lactobacillus casei).
Po provedení PCR s izolovanou DNA byly PCR produkty detekovány pomocou agarosovej gelovej elektroforézy. Metódou PCR bola ověrená úspešnosť izolácie DNA probiotických bakterií pomocou fenolovej extrakcie, vysolováním chloridom sodným i magnetickou separáciou s využitím rôznych magnetických nosičov. Metoda magnetickej separace s využitím magnetických mikročástic bola taktiež ověřena pre izoláciu DNA v kvalite vhodné pro PCR u probiotických kysaných mléčných výrobků.