Izolácia nukleových kyselín, či už ide o DNA alebo RNA, predstavuje základný a nevyhnutný prvý krok v širokej škále experimentov molekulárnej biológie. Cieľom tohto procesu je získať cieľovú nukleovú kyselinu v dostatočnom množstve a predovšetkým vo vysokej kvalite, čo znamená zbavenú akýchkoľvek prímesí nazývaných kontaminanty. Výber vhodného protokolu podlieha predovšetkým potrebe množstva, kvality a druhu finálnej nukleovej kyseliny, ale aj kvantitatívnym, priestorovým, časovým a finančným pomerom.
Na izoláciu nukleových kyselín sa najčastejšie zaužívali dva prístupy - prvý, založený na roztokoch (napr. fenol-chloroformová extrakcia) a druhý, založený na kolónkach (nosičoch). Metóda SILIKA matrice je pomerne stará, aj pri nej nahradil prírodný materiál - diatomit (rozsievková zemina), synteticky pripravený silikagél.
Princíp silikagélovej technológie
Využíva sa princíp kremičitých guličiek s veľkým povrchom, ktorými je naplnená krátka chromatografická kolónka. Vo vodných roztokoch je povrch silikátu hydratovaný. Prídavkom vysokej koncentrácie tzv. chaotropných solí (jodid sodný, guanidín tiokyanát) pri vhodnom pH dôjde k rozbitiu vodíkových mostíkov medzi molekulami vody a povrchom silikátu. Na takto dehydrovaný silikát sa svojimi fosfátovými skupinami s vysokou afinitou viaže DNA. Kontaminujúce látky je potom možné odmyť. Extrakcia pomocou silikátovej pevnej fázy je relatívne jednoduchá a hodí sa aj pre automatizáciu.
| Krok procesu | Popis činnosti |
|---|---|
| Lýza buniek | Rozrušenie membrán pomocou detergentov a proteinázy K v prítomnosti chaotropných solí. |
| Viazanie | Adsorpcia DNA na silikagélovú membránu v kolónke. |
| Premývanie | Odstránenie nečistôt, proteínov a solí pomocou etanolových roztokov. |
| Elúcia | Uvoľnenie čistej DNA z membrány pomocou elučného pufra alebo vody. |
Postup izolácie a purifikácie
Prvým krokom úspešnej izolácie NK je lýza buniek. Jej cieľom je uvoľniť obsah bunky (resp. organel) pomocou jemných detergentov, prípadne ultrazvukom. Bunky sa obvykle rozrušujú v prostredí príslušného extrakčného činidla, ktoré má overenú iónovú silu, reakciu prostredia a obsahuje inhibítory nukleáz. Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napr. EDTA), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy.
Instalace příjmového koše KRM 1200 3T s plniči boxpalet
Po naviazaní DNA na membránu kolónky nasleduje premývanie, pri ktorom sa odstránia nežiaduce bunkové zvyšky a soľné prímesi. Finálnym krokom je elúcia DNA z kolónky, ktorú je možné dosiahnuť alkalickým tlmivým roztokom alebo roztokom s nízkou koncentráciou soli. Výťažky a čistota DNA sú pri tejto metóde vysoké a metóda je vhodná na spracovanie veľkého počtu vzoriek v rutinných laboratóriách.