S vodou je spojené mnoho potenciálnych rizík. Jedným z nich je baktéria Legionella. Legionella je rod baktérií, z ktorých najnebezpečnejšia je Legionella pneumophila. Tieto baktérie sa bežne vyskytujú v nízkych koncentráciách v prírodných vodách, no v umelom prostredí sa môžu rozmnožovať najmä pri nesprávnej údržbe vodovodných rozvodných systémov.
Legionella je druh baktérie, ktorá sa môže dostať do rozvodov pitnej vody cez centrálne vodovodné systémy v budovách. Bežné hodnoty tejto baktérie vo vode však nemusia vyvolávať dôvod k obavám. Problém nastáva vtedy, ak sa premnoží.
História a Výskyt Legionelly
Baktérie Legionella sa bežne vyskytujú vo vode a pôde. Prirodzene obýva sladkovodné prostredia, ako sú rieky, jazerá a vlhká pôda. Baktérie bola tiež nájdená v pôde a komposte, kde prežíva vo vnútri améb a iných mikroorganizmov.
Prvý výskyt legionelly bol zaznamenaný v roku 1976 vo Filadelfii v USA. Stalo sa tak počas zjazdu amerických legionárov v hoteli Bellevue-Stratford. Po akcii ochorelo vyše 180 ľudí a 29 z nich zomrelo. Choroba sa prejavovala horúčkou, kašľom, bolesťami svalov av niekedy aj zápalom pľúc. Vyvolala tak značné obavy a mediálnu pozornosť. Príčinu sa podarilo objasniť až po niekoľkých mesiacoch. Išlo o predtým neznámu baktériu, ktorá dostala meno Legionella pneumophila. Tá sa šírila klimatizačným systémom hotela, konkrétne z chladiacich veží, kde mala ideálne podmienky na množenie.
Nachádza sa v komerčných budovách, nemocniciach, študentských internátoch a domácnostiach. Všetky systémy teplej a studenej vody v obytných budovách sú potenciálnym zdrojom rastu baktérií Legionelly.
Podmienky pre Množenie Legionelly
Dobre sa množí najmä v stojatej vode. Rast baktérií Legionelly podporuje teplota vody 20 - 45°C, pH 5.0 - 8.5, stagnovanie vody, tj. nedostatočná cirkulácia vody vo vodnom systéme a vytvorenie biofilmu, vodného kameňa či hrdze vo vodných systémoch. V priestoroch, kde teplota teplej vody v kotloch alebo zásobníkoch osciluje medzi 20 °C a 50 °C, vzniká ideálne prostredie pre množenie baktérií.
Súčasný výskum však ukazuje, že optimálna teplota je skôr 25-50 °C a že Legionella nerastie pri teplotách nad 65 °C. Do 20°C: prežíva v spiacom štádiu, tj. nie je aktívna.
Baktérie Legionella sa rady usadzujú v potrubiach a nádržiach, kde vytvárajú biofilm - ochrannú vrstvu, ktorá ich chráni pred dezinfekciou a pomáha im priľnúť k povrchom. Legionely sa často usadzujú v sedimentoch a biofilme na stenách potrubia, pričom sa môžu množiť aj v rodinných domoch, ak voda v systéme stojí, netečie a potrubia sa pravidelne nečistia.
Ako sa Legionella šíri a aké ochorenia spôsobuje?
Zdravie človeka môže ohrozovať tým, že sa šíri a rastie v umelých vodných systémoch (sprchové hlavice, kohútiky, zásobníky teplej vody, ohrievače). K infekcii zvyčajne dochádza vdýchnutím aerosólov kontaminovaných touto baktériou. Baktérie sa šíria vdýchnutím kontaminovaného aerosólu, čo sú jemné kvapky vody vznikajúce napríklad pri sprchovaní, vo vírivkách, fontánach alebo v klimatizačných systémoch.
Tradične sa šíri prostredníctvom ventilačných systémov, klimatizácie, systémov dodávky teplej a studenej vody, víriviek, záhradných zavlažovačov a dokonca aj fontán - t. j. zariadení, ktoré počas prevádzky produkujú aerosóly. Vyskytujú sa však aj v prírodných rybníkoch, rekreačných bazénoch atď.
Choroby spôsobené Legionellou
Legionella je patogén schopný infikovať ľudí a spôsobiť dva hlavné typy ochorení: legionársku chorobu a Pontiacku horúčku. Spôsobuje legionársku chorobu, ktorá postihuje najmä ľudí s nízkou imunitou.
- Legionárska choroba: Ide o ťažkú formu pneumónie (akútny zápal pľúc), ktorý môže pretrvávať týždne. Spôsobuje atypický zápal pľúc sprevádzaný horúčkou, suchým kašľom, dýchavičnosťou, bolesťami svalov a hlavy, nevoľnosťou a zmätenosťou. Inkubačná doba je do 10 dní od infikovania.
- Pontiacka horúčka: Má miernejšie prejavy a zápal pľúc sa pri nej nevyskytuje. Sprevádzaná je horúčkou, triaškou a príznakmi podobnými chrípke. Jej priebeh je zvyčajne rýchly a bez komplikácií.
Príznaky legionárskej choroby sú podobné príznakom chrípky, napr. vysoké teploty, horúčky alebo zimnica, bolesti hlavy, únava, bolesti svalov alebo suchý kašeľ. Preto nie je často stanovená správna diagnóza.
Rizikové skupiny a Diagnostika
Legionárskou chorobou sa môžu nakaziť hlavne chronicky chorí ľudia, osoby s oslabeným imunitným systémom. Riziko vzniku legionárskej choroby majú najmä osoby staršie ako 65 rokov, fajčiari, konzumenti alkoholických nápojov, ľudia trpiaci chronickými ochoreniami dýchacích ciest alebo obličiek, osoby s oslabeným imunitným systémom a dlhodobo chorí. Zdravý jedinec, bez prítomnosti rizikových faktorov má aj po expozícii Legionellou nízke riziko vzniku legionárskej choroby. Nie každý, kto je vystavený baktérii ochorie.
V prípade podozrenia na legionelózu sa diagnostika opiera najmä o RTG vyšetrenie pľúc a špecifické laboratórne testy. Ak sa legionelóza laboratórnymi testami u pacienta potvrdí, výskyt tohto ochorenia podlieha povinnému hláseniu na Regionálny úrad verejného zdravotníctva (RÚVZ). Ak sa však legionelóza prejaví vo forme Legionárskej choroby, potrebné je čo najskôr zahájiť antibiotickú liečbu makrolidmi (azitromycín) alebo chinolónmi (levofloxacín).
Čo je legionárska choroba?
Prevencia Množenia Legionelly vo Vodných Systémoch
Legionárskej chorobe sa dá ľahko predísť zavedením niekoľkých jednoduchých opatrení, ktoré minimalizujú riziko šírenia ochorenia. Existuje množstvo prevádzkových, stavebných a procesných opatrení na prevenciu množenia baktérie Legionella v pitnej vode. Tam, kde je to možné, by mala byť uplatnená kombinácia týchto opatrení.
Kľúčové faktory pre prevenciu
Pri navrhovaní a údržbe systémov studenej a teplej vody je dôležité zohľadniť niekoľko faktorov, ktoré môžu ovplyvniť rast baktérií Legionella. Kľúčové faktory zahŕňajú teplotu vody, dobu zadržania, materiál potrubia a pravidelnú údržbu. Kľúčový je pohyb vody - stojatá voda je ideálnym živným prostredím pre Legionella. Mŕtve vetvy sa vyskytujú v nepoužívaných častiach potrubia, kde sa hromadí stojatá voda. Tieto časti môžu byť veľmi krátke (napr. 25 cm) a aj tak predstavujú riziko.
Technické a Procesné Opatrenia
Jedným z kľúčových procesných opatrení na prevenciu množenia baktérie je dodržiavanie teplotných limitov. Odporúča sa, aby teplá voda dosahovala teplotu minimálne 50 °C a cirkulovala v celom systéme. Pre elimináciu baktérií je ideálne udržiavanie teploty teplej vody v obehu nad 55 °C a na výstupe nad 60 °C.
Okrem toho, že je potrebné zabezpečiť nepretržitý obeh vody v potrubí, je nevyhnutné predchádzať neprijateľným poklesom teploty v prípade teplej vody a nárastom teploty studenej vody.
Význam tepelnej izolácie
Rozvody studenej vody musia byť chránené proti teplu zabezpečením dostatočného priestoru okolo potrubia alebo riadnou izoláciou. Podľa európskej normy DIN EN 806-2 nesmú byť rozvody studenej pitnej vody inštalované v trasách rozvodov centrálneho vykurovania a teplovodných rozvodov.
Požiadavky na izolačné materiály
Minimálna hrúbka izolačného materiálu pre potrubia a armatúry musia spĺňať miestne alebo národné požiadavky. Pokiaľ existuje zvýšené riziko výskytu Legionelly, odporúča sa systém takzvanej 100 % izolácie, pri ktorom hrúbka izolačného materiálu zhruba zodpovedá vonkajšiemu priemeru rúrky. Vzhľadom na riziko vzniku kondenzácie je nutné pre rozvody studenej pitnej vody používať iba izolačné materiály s uzavretou bunkovou štruktúrou, ktoré majú vysokú odolnosť proti prenikaniu vodných pár.
Prípady poškodenia potrubia v praxi ukázali, že izolačné materiály s otvorenou bunkovou štruktúrou neposkytujú dostatočnú ochranu proti prestupu vlhkosti. Pri nich vzniká nebezpečenstvo, že vodné pary prenikajúce izoláciou začnú kondenzovať a materiál postupne vlhne, čím sa zhoršujú jeho izolačné vlastnosti a dochádza k energetickým stratám. Izolačné materiály výrobkov rady Armaflex a Tubolit vďaka svojim vynikajúcim technickým vlastnostiam spoľahlivo chránia potrubia pred neprijateľným zvyšovaním alebo znižovaním teploty. Súčasne predchádzajú energetickým stratám na rozvodoch.
Zhrnutie hlavných opatrení
Pre maximálnu ochranu vody je možné tieto opatrenia kombinovať s ďalšími, ako je pravidelné preplachovanie potrubí a udržiavanie správnej teploty vody v kotloch a zásobníkoch (60-65 °C). Pravidelné odbery vzoriek vody a kontrola kvality pomáhajú minimalizovať riziko kontaminácie.
| Opatrenie | Cieľ |
|---|---|
| Udržiavanie teploty vody nad 55 °C | Eliminácia množenia baktérií |
| Izolácia s uzavretou štruktúrou | Zabránenie kondenzácii a vlhnutiu |
| Pravidelné preplachovanie | Odstránenie stojatej vody v potrubí |
Legislatíva a Prevádzkové Kontroly
Prevencia prenosu legionelly cez aerosóly si vyžaduje implementáciu komplexných stratégií vodného manažmentu, ktoré minimalizujú rast a šírenie baktérií v umelých vodných systémoch. Medzi kľúčové opatrenia patrí pravidelné hodnotenie rizík, monitorovanie kvality vody, kontrola teploty, dezinfekcia (napr. ionizácia medi/striebra) a údržba systémov.
Prevádzkovateľ objektu s teplovodným systémom je povinný dodržiavať legislatívne normy, ako sú Zákon č. 355/2007 Z. z. a Vyhláška MZ SR č. 259/2021 Z. z. Kontroly a laboratórne testy vody na prítomnosť baktérie Legionella pneumophila môže vykonávať iba akreditované laboratórium podľa normy STN EN ISO/IEC 17025.
Pri zistení prítomnosti Legionelly nad limitné hodnoty je nutné vykonať nápravné opatrenia, ako je revízia prevádzkového poriadku, obmedzenie používania rizikových výtokových miest alebo vykonanie tepelného šoku.
Odbor epidemiológie v súvislosti s výskytom legionárskej choroby vykonáva epidemiologické vyšetrovanie prípadu, pričom vyšetrovanie sa zameriava na vystavenie pacienta možným rizikovým faktorom a skúmanie prameňa nákazy a faktora prenosu ochorenia. Odbor hygieny životného prostredia a zdravia sa zaoberá monitorovaním a kontrolou vody v rizikových zariadeniach.
Prevencia v Domácnosti
Pravdepodobnosť výskytu Legionelly v domácnosti je veľmi nízka, pretože väčšina domácností neskladuje veľké množstvo vody a voda sa pravidelne používa, takže zvyčajne nestojí v potrubí. Riziko ochorenia v domácnosti môže nastať vtedy, keď sa vo vodnom systéme naskytnú vhodné podmienky pre rast baktérie (teplota od 20 do 45 °C, stagnujúca voda, staré potrubia, slepé vetvy v potrubí, kontaminované kohútiky a sprchové hlavice).
Ako ochrániť svoj domov pred premnožením Legionelly? Zabráňte státiu vody v kohútikoch a sprchových hlaviciach. Udržiavajte ich čisté, bez vodného kameňa či iných usadenín. Skontrolujte, či kotol nie je nastavený na teplotu nižšiu ako 65 °C, najmä v prípade kombinovaných kotlov alebo systémov s akumulačnou nádržou.
Ak sa nasťahujete do nového domu alebo váš dom zostal prázdny aspoň týždeň, mali by ste prepláchnuť vodovodné systémy tak, že vodu vo všetkých sprchách, vaniach, umývadlách, dreze a kohútikoch budete púšťať nepretržite po dobu 5 až 10 minút. Pri preplachovaní sprchy odstráňte sprchovú hlavicu a hadicu položte do vane. Ak hlavicu nemôžete odstrániť, zabaľte ju do uteráka alebo utierky, aby ste sa uistili, že z nej nevyteká aerosól, ktorý by ste mohli vdýchnuť.
Izolácia Nukleových Kyselín: Kľúčový Nástroj v Molekulárnej Biológii a Detekcii Legionelly
Laboratórne testy na prítomnosť baktérie Legionella pneumophila často zahŕňajú metódy molekulárnej biológie, pri ktorých je nevyhnutná izolácia nukleových kyselín (DNA alebo RNA). Izolácia nukleových kyselín je prvým krokom v mnohých experimentoch molekulárnej biológie. Ideálne je potrebné získať cieľovú nukleovú kyselinu (DNA alebo RNA) v dostatočnom množstve a kvalite, to je bez prímesí „nadbytočných” látok, tzv. kontaminantov.
DNA môže byť izolovaná aj z extrémnych zdrojov ako je pôda, úžitková voda, potraviny a iné. Nukleové kyseliny je možné izolovať z rôznych zdrojov. Zdrojom nukleových kyselín môžu byť aj subcelulárne častice - organely alebo vírusy, ktoré získame po izolácii centrifugáciou v hustotnom gradiente.
Výber Metódy Izolácie
Výber metódy izolácie záleží od spôsobu, akým sa bude nukleová kyselina v ďalšom postupe analyzovať. Napr. pri použití metódy PCR (polymerázová reťazová reakcia) postačujú malé množstvá DNA, ktorej čistota a integrita nie sú vo väčšine prípadov kritické. Na druhej strane, pri klonovaní, enzymatickom opracovaní DNA restrikčnými endonukleázami alebo pri sekvenovaní sú potrebné relatívne väčšie množstvá DNA s vyššou čistotou.
Kroky Izolácie Nukleových Kyselín
1. Oddelenie buniek a lýza
V prípade, že sa bunková kultúra pestuje v tekutom médiu, je prvým krokom izolácie oddelenie buniek od média centrifugáciou. Aby došlo k uvoľneniu nukleovej kyseliny do vodného roztoku, je potrebné rozrušiť (dezintegrovať) bunkové steny a biomembrány.
- Lýza bakteriálnych buniek: V prípade niektorých baktérií, ktoré majú veľmi hrubú bunkovú stenu alebo tvoria veľa sekundárnych metabolitov, je výhodné izolovať DNA z buniek v logaritmickej fáze rastu, t.j. pri ich aktívnom hromadnom delení. Na lýzu bakteriálnych buniek sa najčastejšie používa enzymatické opracovanie bunkovej steny lyzozýmom, ktorý hydrolyzuje glykozidické väzby v peptidoglykánoch. Tento enzým sa prirodzene vyskytuje vo vaječnom bielku a v slzách. Druhým krokom je rozrušenie cytoplazmatickej membrány bakteriálnej bunky pôsobením ionogénnych detergentov (detergentov tvoriacich ióny), napr. SDS − dodecylsulfát sodný. Nevzácne je treba okrem chemickej lýzy použiť aj mechanickú lýzu bakteriálnych buniek pomocou ultrasonikátora, ktorý na disrupciu buniek využíva ultrazvukové vlny.
- Lýza rastlinných buniek: Vo všeobecnosti sa ťažšie izolujú nukleové kyseliny z rastlinných buniek kvôli prítomnosti kompaktnej celulózovej bunkovej stene a chemických zlúčenín obsiahnutých vo vakuolárnej šťave. Na uvoľnenie obsahu rastlinných buniek obalených bunkovou stenou sa používa v prvom kroku mechanické ako aj enzymatické opracovanie (celulázy).
- Lýza živočíšnych tkanív: V prípade izolácie nukleových kyselín zo živočíšnych tkanív a celých orgánov (myšacia slezina, pečeň, mozog) je potrebná homogenizácia vstupného materiálu. K tomuto účelu je možné použiť mechanické rozdrvenie v homogenizátore alebo rozrušenie bunkovej hmoty zmrazením v tekutom dusíku. Živočíšne bunky sú obalené len cytoplazmatickou membránou, a preto je možné dosiahnuť ich lýzu jemnejšími prostriedkami, napr. pôsobením slabých neionogénnych detergentov (napr. Triton X-100) v kombinácii s proteolytickými enzýmami. K rozpadu bunkových štruktúr prispieva degradácia proteínov pomocou enzýmov proteáz, napr. proteinázy K.
Dôležitým faktorom je aj prítomnosť chelatačných činidiel (napr. EDTA − kyselina etyléndiamíntetraoctová), ktoré z roztoku „vychytávajú” dvojmocné katióny (Mg²⁺, Ca²⁺), čím inaktivujú bunkové DNázy. Neprítomnosť dvojmocných katiónov zároveň destabilizuje vonkajšiu bakteriálnu membránu.
Pri lýze sa uvoľní celý obsah buniek do roztoku, pričom vznikne komplexná zmes obsahujúca zvyšky bunkových stien a bunkových membrán, proteíny, nukleové kyseliny, polysacharidy a rôzne nízkomolekulové zložky (obzvlášť dôležité pri izolácii z rastlinných buniek kvôli prítomnosti chemických zlúčenín vakuolárnej šťavy). Aby nedochádzalo k degradácii izolovanej nukleovej kyseliny je potrebné použiť čo najmiernejšie podmienky lýzy, t.j. uskutočňovať ju v tlmivom roztoku a v chlade.
2. Purifikácia (Odstránenie kontaminantov)
Princípom purifikácie akéhokoľvek materiálu z buniek je cieľom zbaviť sa zložiek, ktoré pri ďalšej práci nepotrebujeme. Pri izolácii nukleových kyselín je dôležité odstrániť zo zmesi proteíny, medzi ktoré patria aj bunkové nukleázy, ktoré môžu degradovať izolovanú nukleovú kyselinu, ako aj proteíny viažúce sa na DNA, ktoré svojou prítomnosťou môžu rušiť následné analýzy (napr. štiepenie restrikčnými endonukleázami).
- Odstránenie proteínov: Na odstránenie proteínov z preparátov nukleových kyselín sa často používa extrakcia organickými rozpúšťadlami (fenol, chloroform = trichlórmetán). Tieto látky sú s vodou nemiešateľné, a preto sa po ich pridaní k vodnému roztoku nukleových kyselín vytvoria dve fázy. Pri premiešaní takejto zmesi dochádza na fázovom rozhraní k denaturácii proteínov. Ak sa roztok nukleových kyselín extrahuje fenolom s neutrálnym pH, nukleové kyseliny zostávajú po extrakcii vo vodnej fáze. Po fenolovej extrakcii je dôležité zbaviť roztoky nukleových kyselín zvyškov fenolu, pretože fenol môže inhibovať následné enzymatické reakcie (napr. restrikčné štiepenie).
- Odstránenie RNA z DNA: Na odstránenie RNA z preparátov DNA sa používa pankreatická RNáza. Tento enzým je veľmi stabilný a zároveň nevyžaduje pre svoju aktivitu dvojmocné ióny, čo neplatí napr. pre DNázy.
- Odstránenie DNA z RNA: Pri izolácii RNA je zas dôležitým krokom odstránenie prímesí genomickej DNA, čo zabezpečí pankreatická DNáza.
3. Koncentrácia (Alkoholové zrážanie)
Na prečistenie nukleových kyselín od nízkomolekulových látok (soli, zvyšky fenolu) a na skoncentrovanie vzorky sa používa alkoholové zrážanie (najčastejšie čistým, bezvodým etanolom alebo izopropanolom). Zrážanie sa robí v prítomnosti jednomocných iónov (napr. 0,1 M octan sodný) a pri nízkej teplote (-20 °C). V týchto podmienkach je výťažok kvantitatívny aj pri nízkej koncentrácii DNA. Na druhej strane, zrážanie pri laboratórnej teplote (+20 °C) je výhodné, ak chceme vyzrážať DNA bez súčasného vyzrážania („oživenia”) kontaminujúcej RNA. Vyzrážaná nukleová kyselina sa nazýva precipitát.
Precipitát DNA sa od roztoku oddelí vysokootáčkovou centrifugáciou. Premytím 70 % etanolom sa odstránia zvyšky solí prítomné v precipitáte a precipitát sa vysuší tak, aby sa odparili zvyšky etanolu, ale zároveň aby DNA zostala hydratovaná. Molekula DNA v kyslom prostredí môže spontánne degradovať, a preto sa DNA rozpúšťa v slabo zásaditom tlmivom roztoku s prídavkom EDTA (tzv. roztok TE).
4. Špecifické metódy a výzvy
DNA môže byť purifikovaná zo zmesi makromolekúl ultracentrifugáciou za pomoci chloridu cézneho (CsCl) a etídium bromidu. DNA sa skoncentruje do úzkeho prúžku v strede gradiantu, pričom lineárna a cirkulárna (plazmidová) DNA majú inú hustotu, a preto je možné ich touto metódou navzájom oddeliť. Po centrifugácii sa vyberú frakcie obsahujúce DNA, etídium bromid sa odstráni extrakciou n-butanolom a DNA sa z roztoku získa etanolovou precipitáciou. Výsledkom tejto techniky je vysokomolekulárna DNA s vysokou čistotou.
Izolácia RNA
Pri izolácii RNA z akéhokoľvek biologického materiálu je hlavným problémom jej nestabilita. Molekula RNA podlieha degradácii oveľa ľahšie ako DNA a zároveň ribonukleázy sú vo všeobecnosti veľmi stabilné a všadeprítomné enzýmy, ktoré nepotrebujú k svojej aktivite ako kofaktory dvojmocné ióny, na rozdiel od DNáz. RNáza sa skutočne vyskytuje všade. Vylučuje sa aj potnými žľazami na končekoch prstov, takže práca bez rukavíc je absolútne neprípustná.
Metódy izolácie a purifikácie RNA sú založené na rýchlej lýze buniek, ktorá efektívne neutralizuje prítomné nukleázy. Kontaminujúce bielkoviny sa odstraňujú fenolovou extrakciou v kyslom prostredí alebo na silikagélových kolónkach. Zvyšky chromozomálnej DNA je možné rozložiť pôsobením DNázy. Purifikovaná RNA sa využíva na prípravu komplementárnej DNA (cDNA), northernovu hybridizáciu, RT-PCR, alebo na in vitro transláciu.
Pri mnohých aplikáciách je výhodné použiť iba frakciu mRNA. V princípe, izolácia mRNA spočíva vo využití prirodzenej enzymatickej posttranskripčnej modifikácie eukaryotickej mRNA, a to je pridávanie poly(A)-chvostíka na 3'-koniec molekuly mRNA za pomoci enzýmu poly(A)-polymerázy. Oligo-dT nosiče sú jednoduché plôšky, na ktorých sú fixované jednovláknové molekuly so sekvenciou poly(T), a teda sú komplementárne k jednovláknovým mRNA s poly(A) koncami. Ak sa roztok s prítomnými mRNA naleje na tieto nosiče, v prostredí s vyššou iónovou silou (pridanie solí) dochádza k hybridizácii, a teda zachytávaniu mRNA na týchto nosičoch.